Навколо нас багато невідомих героїв, які здаються звичайними, але насправді вони мовчки роблять великий внесок у наш розвиток. Протеїназа К є «невідомим героєм» у галузі молекулярної діагностики, хоча порівняно з «великими та могутніми» в галузі протеїназа К настільки маловідома, що ми довго не помічали її важливості. Зі спалахом нової епідемії коронавірусу попит на протеїназу К різко зріс, а пропозиція в країні та за кордоном значно відстає від споживання, і всі раптом усвідомили, наскільки важлива протеїназа К.
Яке застосування протеїнази К?
Протеїназа К — це серинова протеаза з протеолітичною ферментативною активністю, яка може підтримувати активність у широкому діапазоні середовищ (pH (4-12,5), буфер з високим вмістом солі, висока температура 70°C тощо). Крім того, активність протеїнази К не пригнічується SDS, сечовиною, EDTA, гуанідину гідрохлоридом, гуанідину ізотіоціанатом тощо, а певна кількість миючого засобу також може посилити активність протеїнази К. Протеїназа К має різні застосування в медичному лікуванні (дезінфекція від вірусів та мікробів), харчових продуктах (розм'якшення м'яса), шкірі (пом'якшення волосся), виноробстві (освітлення спирту), підготовці амінокислот (деградоване пір'я), екстракції нуклеїнових кислот, гібридизації in situ тощо. Найчастіше використовується екстракція нуклеїнових кислот.
Протеїназа К може ферментувати всі види білків у зразку, включаючи ті гістони, які міцно зв'язані з нуклеїновими кислотами, завдяки чому нуклеїнові кислоти можуть вивільнятися зі зразка та потрапляти в екстракт, що полегшує наступний етап екстракції та очищення. При виявленні вірусної нуклеїнової кислоти протеїназа К є одним з важливих компонентів розчину для відбору вірусних проб. Протеїназа К може розщеплювати та інактивувати білок оболонки вірусу, що безпечніше під час стадії транспортування та виявлення; крім того, протеїназа К також може розщеплювати РНКазу, запобігаючи деградації вірусної РНК та полегшуючи виявлення нуклеїнових кислот.
Миттєва слава протеїнази К
Чи то в галузі наукових досліджень, чи в галузі діагностики міжклітинних захворювань, екстракція нуклеїнових кислот є найпростішим експериментом, тому протеїназа К завжди була дуже важливою. Однак у минулому протеїназа К була набагато менш відомою, ніж її роль. Значною мірою це було пов'язано з тим, що співвідношення попиту та пропозиції протеїнази К було дуже стабільним. Мало хто міг би подумати, що постачання протеїнази К буде проблемою.
Зі спалахом нової епідемії коронавірусу попит на тестування нуклеїнових кислот різко зріс. Станом на кінець червня 2020 року Китай завершив майже 90 мільйонів нових тестів на коронавірус, і ця цифра є ще більш тривожною у світовому масштабі. В експериментах з екстракції нуклеїнових кислот робоча концентрація протеїнази К становить близько 50-200 мкг/мл. Зазвичай для екстракції зразка нуклеїнової кислоти потрібно близько 100 мкг протеїнази К. На практиці, щоб підвищити ефективність екстракції нуклеїнових кислот, протеїназу К часто використовують у збільшеній кількості. Виявлення нуклеїнових кислот нового коронавірусу призвело до великого попиту на протеїназу К. Початковий баланс попиту та пропозиції протеїнази К був швидко порушений, і протеїназа К за одну ніч стала важливим матеріалом для запобігання епідемії.
Труднощі у виробництві протеїнази К
Хоча з розвитком епідемії люди оцінили важливу цінність протеїнази К, бентежить те, що через надмірну низьку цінність протеїнази К, мало вітчизняних компаній займаються виробництвом протеїнази К. Коли люди хочуть налагодити виробництво протеїнази К. Під час виробничого процесу було виявлено, що протеїназа К є надзвичайно особливим білком. Розширити виробничі потужності протеїнази К за короткий проміжок часу надзвичайно складно.
Масштабне виробництво протеїнази К стикається з такими труднощами
1. Низька експресія
Протеїназа К може неспецифічно розкладати більшість білків та спричиняти серйозну токсичність для клітини-хазяїна, що експресує. Тому рівень експресії протеїнази К зазвичай дуже низький. Скринінг систем експресії та штамів, які високо експресують протеїназу К, зазвичай вимагає тривалішого циклу.
2. Залишки пігментів та нуклеїнових кислот
Великомасштабна ферментація вводить велику кількість пігменту та залишків нуклеїнових кислот хазяїна. Ці домішки важко видалити за допомогою простого процесу очищення, а складне очищення збільшує вартість та знижує коефіцієнт відновлення.
3. Нестабільність
Протеїназа К недостатньо стабільна, вона може ферментувати себе, і її важко стабільно зберігати при 37°C протягом тривалого часу без захисного агента.
4. Легко випадає в осад
Під час приготування ліофілізованого порошку протеїнази К, щоб забезпечити високий вміст твердих речовин у ліофілізованому порошку, необхідно додавати ліофілізований захисний агент у високій концентрації, але коли концентрація протеїнази К досягає 20 мг/мл і вище, легко утворюється осад, що створює великі труднощі для ліофілізації протеїнази К з високим вмістом твердих речовин.
5. Великі інвестиції
Протеїназа К має сильну протеазну активність і може гідролізувати інші протеази в лабораторії. Тому протеїназа К вимагає спеціалізованих виробничих приміщень, обладнання та персоналу для досліджень, розробок і виробництва.
Розчин протеїнази К від XD BIOCHEM
XD BIOCHEM має зрілу платформу для експресії та очищення білків, а також багатий досвід в експресії та очищенні рекомбінантних білків та оптимізації виробничих процесів. Завдяки швидкому формуванню команди дослідників та розробників, було подолано масштабний процес виробництва протеїнази К. Щомісячний обсяг виробництва ліофілізованого порошку становить понад 30 кг. Продукт має стабільну продуктивність, високу специфічну активність ферментів та не містить залишків цитохрому та нуклеїнових кислот господаря. Зв'яжіться з XD BIOCHEM. Отримайте пробний пакет (електронна пошта:sales@xdbiochem.comТел.: +86 513 81163739).
Технічні рішення XD BIOCHEM включають
Використовуючи багатокопійну плазмідну інтеграцію, відбирають штами з високою експресією та рівнем експресії 8 г/л, що долає проблему низького рівня експресії протеїнази К.
Завдяки впровадженню багатоетапного процесу очищення, залишки цитохрому господаря та нуклеїнових кислот протеїнази К були успішно видалені нижче стандартного значення.
Шляхом високопродуктивного скринінгу захисних буферних формулювань було обрано буфер, який може стабільно зберігати протеїназу К при 37°C.
Скринінгові буфери долають проблему легкої агрегації та осадження протеїнази К при високих концентраціях, і закладають основу для ліофілізаційного сушіння протеїнази К з високим вмістом твердих речовин.
Зразок протеїнази K XD BIOCHEM
Тест на стабільність протеїнази K XD BIOCHEM: після 80 днів за кімнатної температури суттєвих змін активності не спостерігатиметься.
Тест на стабільність протеїнази K XD BIOCHEM: після 80 днів за кімнатної температури суттєвих змін активності не спостерігатиметься.
Порівняння ефекту екстракції нуклеїнових кислот протеїназою K XD BIOCHEM та конкуруючими продуктами. У процесі екстракції нуклеїнових кислот використовуються відповідно протеїназа K XD BIOCHEM та конкурентна протеїназа K. Ефективність екстракції протеїнази K XD BIOCHEM вища, а значення Ct цільового гена нижче.
Час публікації: 31 грудня 2021 р.