ІПТГ (ізопропіл-β-D-тіогалактозид) – це аналог субстрату β-галактозидази, який має високу індуктивність. Під дією ІПТГ індуктор може утворювати комплекс з білком-репресором, внаслідок чого конформація білка-репресора змінюється, і він не може поєднуватися з цільовим геном, що призводить до ефективної експресії цільового гена. Отже, як слід визначати концентрацію ІПТГ під час експерименту? Чим більша, тим краще?
Спочатку давайте зрозуміємо принцип індукції IPTG: лактозний оперон (елемент) E. coli містить три структурні гени, Z, Y та A, які кодують β-галактозидазу, пермеазу та ацетилтрансферазу відповідно. lacZ гідролізує лактозу на глюкозу та галактозу або на алолактозу; lacY дозволяє лактозі з навколишнього середовища проходити через клітинну мембрану та потрапляти в клітину; lacA переносить ацетильну групу з ацетил-CoA на β-галактозид, що передбачає усунення токсичного ефекту. Крім того, існує операційна послідовність O, стартова послідовність P та регуляторний ген I. Код гена I - це білок-репресор, який може зв'язуватися з позицією O операторної послідовності, так що оперон (мета) репресується та вимикається. Існує також сайт зв'язування для катаболічного генного активаторного білка - сайту зв'язування CAP вище за ініціаційну послідовність P. Послідовність P, послідовність O та сайт зв'язування CAP разом утворюють регуляторну область lac-оперону. Кодуючі гени трьох ферментів регулюються однією регуляторною ділянкою для досягнення скоординованої експресії генних продуктів.
За відсутності лактози lac-оперон (мета) перебуває у стані репресії. У цей час lac-репресор, що експресується послідовністю I під контролем промоторної послідовності PI, зв'язується з послідовністю O, що запобігає зв'язуванню РНК-полімерази з послідовністю P та пригнічує ініціацію транскрипції; за наявності лактози може індукуватися lac-оперон (мета). У цій системі оперонів (мета) справжнім індуктором не є сама лактоза. Лактоза потрапляє в клітину та каталізується β-галактозидазою, перетворюючись на алолактозу. Остання, як молекула індуктора, зв'язується з білком-репресором та змінює конформацію білка, що призводить до дисоціації білка-репресора від послідовності O та транскрипції. Ізопропілтіогалактозид (IPTG) має такий самий ефект, як і алолактоза. Це дуже потужний індуктор, який не метаболізується бактеріями та є дуже стабільним, тому його широко використовують у лабораторіях.
Як визначити оптимальну концентрацію ІПТГ? Візьмемо, наприклад, кишкову паличку.
Генетично модифікований штам E. coli BL21, що містить позитивний рекомбінантний pGEX (CGRP/msCT), інокулювали в рідке середовище LB, що містить 50 мкг·мл-1 Amp, та культивували протягом ночі при 37°C. Вищезазначену культуру інокулювали у 10 флаконів по 50 мл свіжого рідкого середовища LB, що містить 50 мкг·мл-1 Amp, у співвідношенні 1:100 для розширення культури, і коли значення OD600 становило 0,6~0,8, додавали IPTG до кінцевої концентрації. Вона становила 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 ммоль·л-1. Після індукції за тієї ж температури та в той самий час з нього відбирали 1 мл бактеріального розчину, бактеріальні клітини збирали центрифугуванням та піддавали SDS-PAGE для аналізу впливу різних концентрацій IPTG на експресію білка, а потім вибирали концентрацію IPTG з найбільшою експресією білка.
Після експериментів буде виявлено, що концентрація IPTG не є максимально можливою. Це пояснюється тим, що IPTG має певну токсичність для бактерій. Перевищення концентрації також призведе до загибелі клітини; і загалом, ми сподіваємося, що чим більше розчинного білка експресується в клітині, тим краще, але в багатьох випадках, коли концентрація IPTG занадто висока, утворюється велика кількість включень. В організмі, але кількість розчинного білка зменшується. Тому найбільш підходяща концентрація IPTG часто не чим більша, тим краще, а чим нижча концентрація.
Метою індукції та культивування генетично модифікованих штамів є збільшення виходу цільового білка та зниження витрат. На експресію цільового гена впливають не лише власні фактори штаму та плазміда експресії, але й інші зовнішні умови, такі як концентрація індуктора, температура індукції та час індукції. Тому, загалом, перед експресією та очищенням невідомого білка найкраще вивчити час індукції, температуру та концентрацію IPTG, щоб вибрати відповідні умови та отримати найкращі експериментальні результати.
Час публікації: 31 грудня 2021 р.