IPTG (ізопропіл-β-D-тіогалактозид) є аналогом субстрату β-галактозидази, який є високо індукованим.Під час індукції IPTG індуктор може утворювати комплекс з білком-репресором, таким чином конформація білка-репресора змінюється, так що він не може поєднуватися з цільовим геном, і цільовий ген експресується ефективно.Отже, як слід визначати концентрацію ІПТГ під час експерименту?Чим більше, тим краще?
По-перше, давайте зрозуміємо принцип індукції IPTG: лактозний оперон (елемент) E. coli містить три структурні гени, Z, Y і A, які кодують β-галактозидазу, пермеазу та ацетилтрансферазу відповідно.lacZ гідролізує лактозу в глюкозу і галактозу або в ало-лактозу;lacY дозволяє лактозі в навколишньому середовищі проходити через клітинну мембрану і проникати в клітину;lacA переносить ацетильну групу з ацетил-КоА на β-галактозид, що передбачає усунення токсичного ефекту.Крім того, існує робоча послідовність O, вихідна послідовність P і регуляторний ген I. Код гена I є білком-репресором, який може зв’язуватися з позицією O послідовності оператора, таким чином оперон (мета) репресується і вимкнений.Існує також сайт зв’язування для білка-активатора катаболічного гена – сайт зв’язування CAP перед ініціюючою послідовністю P. Послідовність P, послідовність O та сайт зв’язування CAP разом складають регуляторну область lac-оперону.Гени, що кодують три ферменти, регулюються однією і тією ж регуляторною областю для досягнення узгодженої експресії генних продуктів.
За відсутності лактози lac-оперон (мета) знаходиться в стані репресії.У цей час lac-репресор, який експресується послідовністю I під контролем послідовності промотора PI, зв’язується з послідовністю O, що перешкоджає зв’язуванню РНК-полімерази з послідовністю P і інгібує ініціацію транскрипції;коли лактоза присутня, lac-оперон (мета) може бути індукований. У цій системі оперонів (мета) справжнім індуктором є не сама лактоза.Лактоза потрапляє в клітину і каталізується β-галактозидазою для перетворення в алолактозу.Останній як молекула-індуктор зв'язується з білком-репресором і змінює конформацію білка, що призводить до дисоціації білка-репресора від послідовності О і транскрипції.Ізопропілтіогалактозид (ІПТГ) має таку ж дію, як і алолактоза.Це дуже потужний індуктор, який не метаболізується бактеріями і дуже стабільний, тому широко використовується в лабораторіях.
Як визначити оптимальну концентрацію ІПТГ?Візьмемо, наприклад, кишкову паличку.
Генно-інженерний штам E. coli BL21, що містить позитивний рекомбінантний pGEX (CGRP/msCT), інокулював у рідке середовище LB, що містить 50 мкг·мл-1 Amp, і культивував протягом ночі при 37°C.Вищевказану культуру інокулюють у 10 пляшок із 50 мл свіжого рідкого середовища LB, що містить 50 мкг·мл-1 Amp у співвідношенні 1:100 для розмноження культури, і коли значення OD600 становило 0,6~0,8, IPTG додавали до кінцевої концентрації.Він дорівнює 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 ммоль·л-1.Після індукції при тій же температурі та в той самий час з нього брали 1 мл бактеріального розчину, бактеріальні клітини збирали центрифугуванням і піддавали SDS-PAGE для аналізу впливу різних концентрацій IPTG на експресію білка, а потім виберіть концентрацію IPTG з найбільшою експресією білка.
Після експериментів буде виявлено, що концентрація IPTG не настільки велика, наскільки це можливо.Це тому, що ІПТГ має певну токсичність для бактерій.Перевищення концентрації також призведе до загибелі клітини;і взагалі кажучи, ми сподіваємося, що чим більше розчинного білка експресується в клітині, тим краще, але в багатьох випадках, коли концентрація IPTG занадто висока, утворюється велика кількість включень.Тіло, але кількість розчинного білка зменшилася.Тому найбільш прийнятною концентрацією IPTG часто є не чим більше, тим краще, а чим нижча концентрація.
Метою індукції та культивування генно-інженерних штамів є збільшення виходу цільового білка та зниження витрат.На експресію цільового гена впливають не тільки власні фактори штаму та плазміда експресії, а й інші зовнішні умови, такі як концентрація індуктора, температура індукції та час індукції.Тому, як правило, перед експресією та очищенням невідомого білка найкраще вивчити час індукції, температуру та концентрацію IPTG, щоб вибрати відповідні умови та отримати найкращі експериментальні результати.
Час публікації: 31 грудня 2021 р