Дитіотреїтол (DTT) є широко використовуваним відновником, також відомим як нова зелена добавка.Це низькомолекулярна органічна сполука з двома меркаптановими групами (-SH).Завдяки своїм відновним властивостям і стабільності DTT широко використовується в біохімії та експериментах з молекулярної біології.
Основна роль DTT полягає у зменшенні дисульфідних зв'язків у білках та інших біомолекулах.Дисульфідний зв’язок є важливою частиною згортання та стабільності білка, але за певних експериментальних умов, таких як відновлюваний SDS-PAGE аналіз, рекомбінація та згортання білка, необхідно звести дисульфідний зв’язок до двох тіолових груп, щоб розгадати просторову структуру білок.DTT може реагувати з дисульфідними зв’язками, щоб відновити їх до меркаптанових груп, таким чином відкриваючи просторову структуру білка та полегшуючи його аналіз та маніпулювання.
DTT також можна використовувати для захисту активності та стабільності ферменту.У деяких реакціях, які каталізуються ферментами, активність ферменту може бути знижена окислювачем.DTT може реагувати з окислювачами, перетворюючи їх на нешкідливі речовини, тим самим захищаючи активність і стабільність ферменту.
У порівнянні з традиційними відновниками, такими як β-меркаптоетанол (β-ME), DTT вважається безпечнішим і стабільнішим відновником.Він не тільки стабільний у водному розчині, але також зберігає свої відновні властивості при високій температурі та кислотно-лужних умовах.
Використання DTT відносно просте.Загалом DTT розчиняють у відповідному буфері, а потім додають до експериментальної системи.Оптимальна концентрація DTT повинна бути визначена відповідно до конкретного експерименту, і зазвичай використовується в діапазоні 0,1-1 мМ.Нижчі концентрації можуть зменшити несприятливий вплив на ріст клітин і можуть зменшити цитотоксичність через надмірну експресію цільових білків.Вищі концентрації можуть спричинити надмірне метаболічне навантаження на клітини, впливаючи на ріст клітин і ефективність експресії.
Способом визначення оптимальної концентрації може бути оцінка рівня експресії цільового білка шляхом проведення індукційних тестів IPTG при різних концентраціях.Маломасштабні культуральні тести можна проводити з використанням діапазону концентрацій IPTG (наприклад, 0,1 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ тощо), а ефект експресії при різних концентраціях можна оцінити шляхом визначення рівня експресії цільового білка (наприклад, Western блот або флуоресцентне виявлення).Згідно з результатами експерименту, концентрація з найкращим ефектом експресії була обрана як оптимальна концентрація.
Крім того, ви також можете звернутися до відповідної літератури або досвіду інших лабораторій, щоб зрозуміти діапазон концентрації IPTG, який зазвичай використовується в аналогічних експериментальних умовах, а потім оптимізувати та налаштувати відповідно до експериментальних потреб.
Важливо відзначити, що оптимальна концентрація може змінюватися залежно від різних систем експресії, цільових білків і умов експерименту, тому найкраще оптимізувати її в кожному конкретному випадку.
Підсумовуючи, DTT є широко використовуваним відновником, який можна використовувати для зменшення дисульфідних зв’язків у білках та інших біомолекулах і для захисту активності та стабільності ферментів.Його широко використовували в експериментах з біохімії та молекулярної біології.
Час публікації: 28 вересня 2023 р